本文摘自高分子材料科学，侵删。
【北京介绍】
创伤引起的关节软骨损伤和丧失可能发展为骨关节炎，甚至仍然是年轻患者残疾的原因，构成重大的社会经济负担。受损关节软骨组织的再生能力非常低，因为软骨细胞的数量和流动性有限，关节软骨组织中没有血管、神经和淋巴管网络。目前，水凝胶被广泛应用于关节软骨的再生。然而，传统的纳米孔隙水凝胶会导致细胞和组织浸润不良。此外，可以刺激软骨再生的各个阶段以加强软骨修复的水凝胶也同样是非常需要的。
【摘要】
水凝胶广泛用于关节软骨再生。然而，具有纳米级孔隙的传统水凝胶会导致细胞和组织浸润不良。此外，非常需要能够刺激软骨再生的各个阶段以增强软骨修复的水凝胶。最近，科研人员 通过首先将混合的海藻酸钠 (SA) 和透明质酸 (HA) 溶液交联成 SA/HA 微纤维 (µ- 纤维)，然后将 µ- 纤维交联成水凝胶块来制造大孔水凝胶。此外，由脂多糖 (LPS) 激活并用生物玻璃 (BG) 离子提取物 (LPS/BG-exo) 刺激的 NR8383 细胞衍生的外泌体被整合到水凝胶中，因为它们具有很强的调节炎症稳态和募集骨髓间充质干细胞的能力细胞（BMMSC）。同时， 含有kartogenin (KGN) (PLGAKGN) 的聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA) 微球被封装在水凝胶中，用于在LPS/BG-exo 后释放KGN 时诱导募集的BMMSCs 的软骨分化。因此，所获得的大孔 SA/HAexo-PLGAKGN 水凝胶不仅可以显着改善组织对水凝胶的浸润，还可以依次递送 LPS/BG-exo 和 KGN，以增强大鼠软骨缺损模型中的软骨再生。展望未来，SA/HAexo-PLGAKGN 水凝胶是其他组织再生的潜在候选者，因为可以根据不同目的调整生物活性物质。
图1. SA/HAexo-PLGAKGN支架的制备及通过SA/HAexo-PLGAKGN支架连续促进多软骨再生阶段示意图。A) LPS/BG- exo 的制备。B) SA/HA exo -PLGA KGN 支架的制备。C) 关节软骨缺损模型。D) 从SA/HA exo -PLGA KGN 支架依次释放LPS/BG-exo和KGN，调节炎症稳态，募集内源性BMMSCs，有序诱导BMMSCs的软骨细胞分化。
【图文解析】
文中作者设计并制备了一种新型的可注射大孔水凝胶系统，该系统由负载特定外泌体的SA/HA µ-纤维水凝胶和PLGAKGN微球组成，用于将生物活性物质依次输送到每个伤口愈合阶段，并有利于细胞/组织浸润，通过大孔增强软骨再生(图1)，BG离子提取物对LPS激活的NR-8383细胞极化的影响（图2），外泌体对巨噬细胞炎症调节的影响（图3）。
图2. A)不同浓度BG离子提取物培养LPS激活的NR8383细胞在第1、2、3天ARG/iNOS基因表达的比值。B)不同外泌体的透射电镜图像(外泌体用箭头表示)。C)纳米粒子跟踪分析测量不同外泌体的粒径分布。D) 蛋白免疫印迹定量不同外泌体及相应细胞的表面标记物。E、F) Dio(绿色)标记的不同外泌体内在化的NR8383细胞和BMMSCs的代表性荧光图像。
图3. A)不同外泌体培养的NR8383细胞iNOS、TNF-α、IL-1β和CD86的基因表达。B)不同外泌体培养的NR8383细胞中ARG、IL-10、IL-1Ra和CD206的基因表达。C)不同外泌体激活的NR8383细胞及不同组M1、M2原型巨噬细胞比值的FACS结果。D)不同外泌体培养的NR8383细胞中CCL17、CCL22、CCL24和CXCL13的基因表达。
图4. A) 用不同外泌体培养的 BMMSCs 的划痕试验。B) BMMSCs在不同外泌体培养的Transwell中的迁移和BMMSCs在不同外泌体培养的Transwell中迁移的数量。C) 来自用不同外泌体培养的 BMMSCs 的 MMP-2、uPA、CXCR4 和 PDGFR 的基因表达。D) 用不同外泌体培养的 BMMSCs 中 CXCR4 的免疫细胞化学染色。
【外泌体对BMMSCs迁移的影响】
采用划痕法和Transwell迁移法研究LPS-exo和LPS/BG-exo对BMMSCs迁移的影响。在第0天的划伤试验中，所有BMMSCs被移液管尖划伤后均显示出相同宽度的伤口(图4A)。结果发现，与含LPS/BG-exo的培养基相比，含有LPS/BG-exo的培养基能刺激更多的BMMSCs通过Transwell膜迁移。LPS-exo和LPS/BG-exo均能促进BMMSCs的迁移，而LPS/BG-exo对BMMSCs迁移能力的刺激作用强于LPS-exo。在两种含外泌体的培养基中，LPS/BG-exo对CXCR4和PDGFR基因表达的刺激作用强于LPS-exo，表明LPS/BG-exo可通过上调迁移相关基因的表达，强烈促进BMMSCs的迁移。
图5. A) 不同条件下培养的 BMMSCs 阿新蓝染色。B) 在不同条件下培养的 BMMSCs 中 Col II 的免疫荧光染色。C) 不同条件下培养的 BMMSCs 中 Sox-9、Col II 和 Acan 的基因表达情况。D) BMMSCs 颗粒的总体外观。E) 不同条件下培养21天的颗粒阿新蓝染色。F) 在不同条件下培养的颗粒体积。
图6. A) SA/HAexo-PLGAKGN 支架制备的制造过程。B-a,b) 离子交联和 B-c,d) 紫外交联后 SA/HAexo-PLGAKGN 支架的形态。C-a、b) 荧光图像、C-c) 明场图像和 C-d) SA/HAexo-PLGAKGN µ 纤维的合并图像。D-a1,b1)冻干前SA/HAexo-PLGAKGN支架;D-c,c1)冻干后HG支架和SA/HAexo-PLGAKGN支架的SEM图像。
图7. A) HG 支架和 SA/HAexo-PLGAKGN 支架的降解行为。B）没有生物活性物质的HG支架和SA/HA-PLGA支架对宿主组织的浸润。C-D) HG 支架和 SA/HAexo-PLGAKGN支架的机械性能。E) SA/HAexo-PLGAKGN支架的释放行为。
【总结】
该研究设计了一种智能可注射大孔水凝胶旨在改善组织浸润并依次输送生物活性物质以增强软骨再生。大孔水凝胶是通过首先将 SA/HA 交联成 µ-纤维，然后将 µ-纤维进一步交联成水凝胶块来制造的。此外，发现由 BG 离子提取物刺激的 LPS 激活的 NR8383 细胞衍生的外泌体能够有效调节炎症稳态并募集内源性 BMMSCs，而用 PLGAKGN 微球包裹的 KGN 可以显着诱导 BMMSCs 的软骨分化。因此，将LPS/BG-exo和PLGAKGN掺入水凝胶中， SA/HAexo-PLGAKGN水凝胶可以依次释放LPS/BG-exo和KGN来调节炎症反应，促进内源性BMMSCs迁移，诱导软骨细胞分化BMMSCs 逐步进行。同时，水凝胶的大孔结构有利于诱导细胞和组织的浸润。总之，SA/HAexo-PLGAKGN 水凝胶是一种有前途的刺激关节软骨再生的支架。更重要的是，这种水凝胶在再生其他类型组织方面具有巨大的应用潜力，因为其生物活性物质可以很容易地针对不同目的进行调整。
该论文以题目为“Smart µ-Fiber Hydrogels with Macro-Porous Structure for Sequentially Promoting Multiple Phases of Articular Cartilage Regeneration”发表在《 Advanced Functional Materials 》期刊上。通讯作者是上海交通大学的李海燕特别研究员和上海交通大学附属第六人民医院的何耀华主任医师。
参考文献：
https://doi.org/10.1002/adfm.202113380
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